Ortegocactus macdougallii. Organogeneza, namnażanie i tworzenie korzeni

Od brodawki do nowego pędu

Ortegocactus macdougallii jest jedynym gatunkiem rodzaju przyjmowanym obecnie przez Plants of the World Online. Jego naturalny zasięg znajduje się w Oaxaca. W publikacjach stosujących szeroko ujętą Cochemiea spotyka się nazwę Cochemiea macdougallii. Wyniki wcześniejszej pracy Arellano-Perusquíi i współautorów dotyczą tej samej rośliny. Ogłoszone w 2013 r. doświadczenie śledziło reakcję niewielkich fragmentów pędu na regulatory wzrostu, następnie namnażanie uzyskanych pędów i tworzenie korzeni. Te etapy oceniano odrębnie, ponieważ odpowiedź prowadząca do powstania pąka różniła się od warunków sprzyjających jego dalszemu wzrostowi i ukorzenieniu. [Arellano-Perusquía i wsp. 2013, Arellano-Perusquía i wsp., s. 160–161; Breslin i wsp., s. 319; POWO, karty rodzaju i gatunku][2-WWW][2-WWW][Breslin i wsp. 2021, Arellano-Perusquía i wsp., s. 160–161; Breslin i wsp., s. 319; POWO, karty rodzaju i gatunku]

Materiał pochodził z siedmioletnich roślin zakupionych w szkółce. Przez rok utrzymywano je w szklarni, po czym pobierano młode pędy długości 0,5–1,5 cm. Po odkażeniu wycinano pojedyncze brodawki lub fragmenty z kilkoma brodawkami, obejmujące od jednej do trzech areoli. Taki eksplant zawierał już miejsca, w których występują merystemy areolowe, oraz tkanki położone pomiędzy nimi. Autorzy mogli więc porównać aktywację istniejących punktów wzrostu z pojawieniem się pąków w innych częściach fragmentu. [Arellano-Perusquía i wsp. 2013, s. 161, Plant material, Micropropagation]

Wspólne środowisko kultury, zmienne regulatory

Pożywką podstawową była MS, opracowana przez Murashige i Skooga. Wszystkie jej warianty zawierały 5% sacharozy i 0,7% agaru. pH ustalano na 5,7. Kultury utrzymywano w temperaturze 27 ± 3°C i szesnastogodzinnym dniu pod białymi lampami fluorescencyjnymi, przy gęstości strumienia fotonów fotosyntetycznie czynnych około 50 µmol m⁻² s⁻¹. Są to warunki wspólne dla doświadczenia z tkankami rosnącymi w pojemnikach na pożywce z cukrem. Podane dalej reakcje odnoszą się do tego środowiska i użytego materiału. [Arellano-Perusquía i wsp. 2013, s. 161, Culture conditions]

W pierwszym etapie zestawiono cytokininę BA, czyli N⁶-benzyloadeninę, z auksyną NAA, kwasem α-naftylooctowym. Regulatory podawano pojedynczo lub łącznie w stężeniach z szeregu 0; 1,3; 4,4; 13,3 µM. Na wariant przypadało sześć eksplantów, a odpowiedź oceniano po 116 dniach. Rejestrowano powstawanie kalusa, pędów oraz korzeni. Ograniczona początkowa liczba fragmentów rośliny nadaje temu etapowi charakter poszukiwania warunków umożliwiających ustanowienie kultury. [Arellano-Perusquía i wsp. 2013, s. 161–162, Micropropagation, Results]

Kalus, aktywacja areoli i organogeneza bezpośrednia

Warianty z NAA wywoływały tworzenie kalusa. Początkowo był on miękki, kruchy, czerwony lub zielony. Później stawał się twardy i zwarty oraz rósł powoli. Wytworzenie tej tkanki świadczyło o reakcji eksplantatu na pożywkę, podczas gdy uzyskanie pędu stanowiło kolejny, osobno obserwowany wynik. Pędy pojawiły się tylko przy połączeniu BA 13,3 µM z NAA 1,3 albo 4,4 µM. W tych dwóch wariantach cztery eksplanty utworzyły łącznie 17 pędów. Sama BA w użytych stężeniach nie pobudziła pąków areolowych do wzrostu. [Arellano-Perusquía i wsp. 2013, s. 162–163, Results, tabela 1]

Oględziny stereoskopowe ujawniły dwie drogi tworzenia pędów. Jedną było uruchomienie merystemów obecnych w areolach. Drugą stanowiło pojawianie się pąków przy brzegach i podstawie eksplantatu oraz pomiędzy brodawkami, w miejscach pozbawionych areoli. Z tych zawiązków rozwijały się pędy z drobnymi brodawkami i typową dla młodych roślin barwą. Autorzy opisali drugi przebieg jako bezpośrednią organogenezę przybyszową, opierając rozpoznanie na miejscu pojawiania się pąków i ich rozwoju. [Arellano-Perusquía i wsp. 2013, s. 162–165, ryc. 1B–G, Results, Discussion]

Rozdzielenie tych dróg ma znaczenie dla rozmnażania klonalnego. Pęd pochodzący z areoli wykorzystuje istniejący merystem, a pęd przybyszowy tworzy nowy punkt wzrostu. Publikacja dokumentuje ich lokalizację i postać widoczną w kulturze. Pochodzenie nowych pąków z określonych komórek oraz wierność genetyczna otrzymanych roślin stanowią odrębne pytania, wymagające badań anatomicznych lub molekularnych. Z tego powodu określenie sposobu organogenezy należy powiązać z obserwacjami, które rzeczywiście przeprowadzono. [Arellano-Perusquía i wsp. 2013, s. 162–165, ryc. 1, Discussion]

Namnażanie, liczba pędów i ich długość

W etapie namnażania utrzymano NAA na poziomie 4,4 µM i porównano trzy stężenia BA wynoszące 13,3; 19,9; 26,6 µM. Każdy wariant obejmował osiem naczyń po sześć eksplantów. Doświadczenie powtórzono dwukrotnie, a wyniki odczytano po 110 dniach. Średnia liczba pędów na eksplant wynosiła około pięciu do sześciu. Porównanie statystyczne nie wykazało różnicy między tymi wariantami ani w liczbie pędów, ani w ich świeżej masie. Różniła się natomiast długość. Najniższe z badanych tu stężeń BA dało dłuższe pędy. [Arellano-Perusquía i wsp. 2013, s. 161, 163–164, tabela 2]

Wariant BA 13,3 µM wraz z NAA 4,4 µM powodował ponadto tworzenie korzeni średnio u 38,83% namnażanych eksplantów. Liczba korzeni wynosiła jednak tylko 1,25 na eksplant. Przy dwóch wyższych stężeniach BA korzeni w tym etapie nie stwierdzono. Wynik pokazuje przesunięcie odpowiedzi rozwojowej w obrębie tych samych kombinacji regulatorów. Do dalszej oceny ukorzeniania przeniesiono więc pędy na inne pożywki, o obniżonej zawartości składników MS. [Arellano-Perusquía i wsp. 2013, s. 164, tabela 3]

Fasciacja przy wyższych stężeniach BA

Przy BA 19,9 i 26,6 µM autorzy obserwowali, obok pędów o zwykłej postaci, również pędy grzebieniaste i monstrualne, określane w pracy jako fasciowane. Ich pojawienie się przy dwóch wyższych stężeniach cytokininy stanowi ważny wynik jakościowy. Większa dawka BA nie zwiększyła istotnie liczby namnażanych pędów, a współwystępowała ze zmianami ich organizacji i mniejszą przeciętną długością. Ocena sprawności rozmnażania obejmuje zatem zarówno liczbę pędów, jak i ich postać oraz dalszy rozwój. [Arellano-Perusquía i wsp. 2013, s. 163–165, tabela 2, Discussion]

W dyskusji autorzy odnoszą fasciację do oddziaływania regulatorów wzrostu i do ogólnie znanych mechanizmów regulujących merystem, w tym genów rodziny CLAVATA. Ten komentarz jest interpretacją na podstawie wcześniejszej literatury. W doświadczeniu z O. macdougallii nie oznaczano ekspresji tych genów, trwałości cechy po przeniesieniu roślin do podłoża ani udziału zmian genetycznych. Udokumentowane jest wystąpienie odmiennych form pędów w określonych wariantach kultury. Ich przyczyna molekularna i późniejsza stabilność pozostają zagadnieniami do sprawdzenia. [Arellano-Perusquía i wsp. 2013, s. 164–165, Discussion]

Oddzielny etap tworzenia korzeni

Ukorzenianie badano przez 50 dni w czterech wariantach. Stosowano jedną czwartą lub połowę stężenia pożywki MS bez regulatorów oraz połowę MS z IBA, kwasem indolilo-3-masłowym, w stężeniu 1,6 albo 4,9 µM. Każdy wariant obejmował osiem naczyń po trzy eksplanty. Zawiązki korzeni były widoczne po około 30 dniach, a po kolejnych 20 dniach wyraźnie wydłużone. Korzenie tworzyły się bez poprzedzającego ich powstawanie kalusa. [Arellano-Perusquía i wsp. 2013, s. 161, 164, Rooting, Results]

Największy średni odsetek pędów tworzących korzenie i największą ich liczbę otrzymano na połowie MS z IBA 4,9 µM. W porównaniu z połową MS bez regulatorów wzrost odsetka ukorzenionych pędów był statystycznie istotny. Wariant z jedną czwartą MS częściowo nakładał się na obie grupy w teście Tukeya. Podobnie IBA 1,6 µM nie dawał jednoznacznej przewagi nad obiema kontrolami. Średnia długość korzeni pozostawała statystycznie podobna we wszystkich wariantach. Stężenie podnoszące udział ukorzenionych pędów i liczbę ich korzeni nie zwiększyło więc wykazanej długości korzenia. [Arellano-Perusquía i wsp. 2013, s. 164, tabela 4, litery grup jednorodnych testu Tukeya]

Oryginalna tabela 4 zawiera przy IBA drukowaną jednostkę mM, natomiast opis metody ukorzeniania i odpowiadający jej tekst wyników podają µM. W powyższym zestawieniu zachowano jednostkę z opisu doświadczenia. Rozbieżność dotyczy czynnika tysiąc, ma więc znaczenie dla odczytania protokołu. Przedstawione wartości opisują badanie laboratoryjne i jego zakres porównania pożywek. [Arellano-Perusquía i wsp. 2013, s. 161, Rooting; s. 164, tekst wyników i tabela 4]

Znaczenie dla rozmnażania i zachowania zasobów

Praca dokumentuje uzyskanie nowych pędów z fragmentów roślin szkółkowych oraz ich ukorzenienie w kulturze. Materiał może powstawać przez aktywację areoli i przez bezpośrednią organogenezę przybyszową, a dobór regulatorów wpływa na udział tych odpowiedzi oraz postać pędów. Dla gatunku o wąskim zasięgu taki sposób namnażania daje podstawę do rozwijania uprawnego źródła roślin. Ocena przydatności w ochronie wymaga również reprezentacji różnych roślin wyjściowych, zachowania ich tożsamości i kontroli kolejnych etapów rozwoju. [Arellano-Perusquía i wsp. 2013, s. 160–161, 165, Introduction, Discussion]

Punktem końcowym opisanych doświadczeń była roślina z pędem i korzeniami uzyskanymi in vitro. Aklimatyzacja i dalszy wzrost poza naczyniem stanowią odrębny etap rozmnażania. [Arellano-Perusquía i wsp. 2013, s. 161, 164–165, zakres metody i wyniki ukorzeniania]