Nasiono wraz ze swoim zespołem mikroorganizmów
W dojrzałym owocu nasiono pozostaje związane z otaczającymi je mikroorganizmami. Część zajmuje powierzchnię łupiny nasiennej, inne występują w wewnętrznych tkankach. Zespół tych drobnoustrojów i ich materiał genetyczny określa się w badaniach jako mikrobiom nasiona. Rozmieszczenie ma znaczenie, ponieważ oba obszary różnią się dostępem do wody, substancji odżywczych i mikroorganizmów z otoczenia. W chwili kiełkowania zmieniają się też dostępne powierzchnie, a korzeń zarodkowy zaczyna wzrastać poza osłonę nasiona. [Mascot-Gómez i wsp. 2021, s. 2]
Mascot-Gómez, Flores i López-Lozano badali Echinocactus platyacanthus, Ferocactus latispinus, F. pilosus i Stenocereus queretaroensis. Dojrzałe, zamknięte owoce pierwszych trzech gatunków pochodziły z Guadalcázar, a czwartego z Sierra de Álvarez, w stanie San Luis Potosí. Zbiór odbył się w porze deszczowej w 2018 r. Dla każdego gatunku uwzględniono co najmniej dziesięć roślin. Po wydobyciu nasiona połączono w jedną próbkę gatunkową, co umożliwiło opis zbiorczy ich mikroorganizmów. [Mascot-Gómez i wsp. 2021, s. 2]
Jak rozdzielić powierzchnię i wnętrze
Drobnoustroje powierzchniowe odzyskiwano przez powolne mieszanie nasion w roztworze buforowym z niewielkim dodatkiem detergentu. Tak uzyskany płyn zawierał komórki odłączone od powierzchni. Aby zbadać wnętrze, kolejną próbkę poddano serii płukań, w tym z etanolem i podchlorynem sodu, a później nasiona rozcierano. Brak wzrostu mikroorganizmów na pożywce po umieszczeniu na niej umytych nasion oraz obrazy mikroskopii skaningowej służyły sprawdzeniu skuteczności usunięcia powierzchniowych komórek. [Mascot-Gómez i wsp. 2021, s. 2, 8]
Autorzy nazwali zespoły powierzchniowe episeminalnymi, a wewnętrzne endoseminalnymi. To podział operacyjny wyznaczony sposobem pobrania próbki. Pokazuje, skąd odzyskano materiał, i ułatwia porównanie grup. Mikroorganizmy mogą jednak przemieszczać się w czasie rozwoju rośliny, dlatego każda próbka przedstawia stan z chwili jej przygotowania. Dla odtworzenia pochodzenia mikrobiomu potrzebne są obserwacje kolejnych stadiów, od kwiatów i owoców po siewkę. [Mascot-Gómez i wsp. 2021, s. 2, 8]
Dwa sposoby wykrywania życia
W pierwszym podejściu mikroorganizmy hodowano na pożywkach. Uzyskano sześćdziesiąt izolatów bakteryjnych z czterech gatunków. Hodowla umożliwiała później oznaczanie ich właściwości. W drugim podejściu izolowano DNA i sekwencjonowano markery, bakteryjny gen 16S rRNA oraz grzybowy region ITS. Porównanie tych sekwencji z bazami referencyjnymi pozwalało przypisywać odczyty do grup taksonomicznych. W analizie uwzględniono kontrole odczynników i wzorcową mieszaninę mikroorganizmów. [Mascot-Gómez i wsp. 2021, s. 3–5]
Hodowla opisuje organizmy rosnące na użytych pożywkach i w zastosowanych warunkach. Analiza DNA ujawnia szerszy zbiór sekwencji, także tych drobnoustrojów, których nie udało się wyhodować. U obu badanych Ferocactus nie otrzymano izolatów grzybowych, chociaż ich markery występowały w próbkach. Względny udział odczytów w analizie DNA określa strukturę badanej biblioteki sekwencji. Liczby żywych komórek i ich aktualnej aktywności trzeba określać odrębnymi pomiarami. [Mascot-Gómez i wsp. 2021, s. 3–5]
Cztery gatunki, różne zespoły
U E. platyacanthus zarówno wewnątrz nasion, jak i na powierzchni ponad 90% odczytów bakteryjnych przypisano do Stenotrophomonas. U F. latispinus ten rodzaj przeważał na powierzchni, natomiast we wnętrzu dominowała Kluyvera. U F. pilosus wnętrze było związane głównie ze Stenotrophomonas, powierzchnia z Paenibacillus. Nasiona S. queretaroensis miały bardziej zróżnicowany zespół bakterii. W danych grzybowych różnice między powierzchnią i wnętrzem były szczególnie wyraźne. [Mascot-Gómez i wsp. 2021, s. 4–6]
Wśród bakterii możliwych do wyhodowania badano wytwarzanie związków indolowych, sideroforów, zdolność rozkładu chityny i aktywność nitrogenazy. Siderofory wiążą żelazo, a aktywność nitrogenazy wskazuje na możliwość wiązania azotu atmosferycznego. Każdy izolat wykazywał przynajmniej jedną oznaczaną cechę wiązaną ze wspieraniem roślin. Takie testy określają potencjał szczepu w warunkach laboratoryjnych. Wpływ na konkretną siewkę zależy od tego, czy bakteria zasiedli ją i zachowa badaną aktywność w jej środowisku. [Mascot-Gómez i wsp. 2021, s. 4–6]
Co się zmieniło po usunięciu zespołu powierzchniowego
Część funkcjonalną przeprowadzono wyłącznie u E. platyacanthus. Porównano nasiona zachowujące naturalną powierzchnię, nasiona umyte oraz pięć wariantów ponownego zaszczepienia umytych nasion. Zaszczepiano je mieszaniną odzyskaną z powierzchni lub pojedynczymi izolatami Bacillus, Burkholderia, Enterobacter i Aspergillus. Każdy wariant obejmował pięć szalek po piętnaście nasion. Kiełkowanie oraz widoczne strzępki grzyba obserwowano przez trzydzieści dni, na agarze w 25°C. [Mascot-Gómez i wsp. 2021, s. 3–4, 6–9]
Nasiona zachowujące naturalną powierzchnię kiełkowały istotnie częściej niż umyte. Żaden wariant ponownego zaszczepienia nie przywrócił kiełkowania do ich poziomu. Mycie usuwało jednocześnie mikroorganizmy i część warstwy śluzowej. Autorzy wskazali tę zmianę osłony jako możliwe wyjaśnienie wyniku. Rozdzielenie efektu śluzu od efektu mikroorganizmów wymaga doświadczenia, w którym każdą z tych cech zmienia się osobno. [Mascot-Gómez i wsp. 2021, s. 3–4, 6–9]
Kolonizacja grzybowa i zależność od szczepu
Umyte nasiona częściej pokrywały się strzępkami grzyba wyizolowanego także z ich wnętrza i oznaczonego jako bliski Aspergillus welwitschiae. Zaszczepienie Enterobacter, powierzchniowym izolatem Aspergillus lub odzyskaną mieszaniną drobnoustrojów obniżało częstość kolonizacji w porównaniu z nasionami umytymi. Efekt ten dotyczył powierzchniowej obecności strzępek. Warianty z Bacillus i Burkholderia nie dały w tym porównaniu istotnego spadku kolonizacji. [Mascot-Gómez i wsp. 2021, s. 6–9]
Dwa izolaty zaliczone do jednego rodzaju grzyba mogły więc odmiennie uczestniczyć w tym samym układzie. Przypisana nazwa rodzaju pomaga ustalić pokrewieństwo, a działanie określa doświadczenie z konkretnym szczepem. W tej pracy niektóre oznaczenia grzybów na poziomie gatunku pozostawały wstępne, oparte na podobieństwie jednego regionu DNA. Obserwowany spadek kolonizacji pozwala rozważać oddziaływania antagonistyczne między mikroorganizmami. Dokładnego mechanizmu hamowania nie wyznaczono. [Mascot-Gómez i wsp. 2021, s. 6–9]
Od próbki nasion do biologii gatunku
Połączenie nasion wielu roślin w jedną próbkę ogranicza możliwość określenia zmienności między roślinami matecznymi. Dane przedstawiają zespoły związane z badanymi populacjami, porą zbioru i sposobem przygotowania materiału. Do ustalenia powtarzalnego mikrobiomu gatunkowego potrzebne są niezależne populacje i kolejne sezony. Badanie funkcjonalne E. platyacanthus dodatkowo pokazuje, że osłona nasiona, mikroorganizmy i kiełkowanie współtworzą układ, którego składowe trzeba rozdzielać pomiarem. [Mascot-Gómez i wsp. 2021, s. 8–9]
Dla badań siewu praktyczną konsekwencją jest dokładny opis przygotowania nasion. Mycie, odkażanie i usuwanie śluzu zmieniają materiał wyjściowy, a ich skutki można ocenić przez równoległe próby kontrolne. Artykuł dostarcza konkretnego przykładu takiej zależności u E. platyacanthus. Skład mikroorganizmów F. latispinus i F. pilosus przedstawiono także w kartach tych roślin, z zachowaniem odrębnego zakresu wyników. [Mascot-Gómez i wsp. 2021, s. 8–9]
Opracowanie na podstawie pełnego tekstu pracy. Wykrywanie sekwencji, hodowlę izolatów i doświadczenie z ponowną inokulacją nasion opisano jako odrębne poziomy badania.
The seed-associated microbiome of four cactus species from Southern Chihuahuan Desert
Mascot-Gómez E., Flores J., López-Lozano N. E., The seed-associated microbiome of four cactus species from Southern Chihuahuan Desert, Journal of Arid Environments, 2021, 190:104531, doi: 10.1016/j.jaridenv.2021.104531
Porównanie bakterii i grzybów powierzchni oraz wnętrza nasion Echinocactus platyacanthus, Ferocactus latispinus, F. pilosus i Stenocereus queretaroensis. Badanie łączy sekwencjonowanie markerów DNA z hodowlą izolatów i oznaczaniem ich cech funkcjonalnych. Osobne doświadczenie u E. platyacanthus ocenia kiełkowanie i kolonizację grzybową po myciu nasion oraz ponownym zaszczepieniu wybranymi mikroorganizmami.