Mammillaria vetula ‘Snowcap’. Odrosty i kwiaty w kulturze in vitro

Gatunek i odmiana uprawna

Materiał opisany przez Lopez-Granero i współautorów jako Mammillaria vetula ssp. gracilis var. Arizonica cv. Snowcap należy do odmiany uprawnej. POWO przyjmuje obecnie gatunek Mammillaria vetula, a nazwę podgatunku gracilis traktuje jako jego synonim. Współczesny zapis Mammillaria vetula ‘Snowcap’ łączy gatunek z nazwą kultywaru. Historyczne brzmienie zachowano w tytule publikacji, aby jej materiał można było odnaleźć. [2-WWW][2-WWW] [Lopez-Granero i wsp. 2023, s. 759–760]

Badane rośliny miały gęste skupienia krótkich białych cierni i liczne odrosty nadające kępie zaokrąglony zarys. Materiał pochodził ze szkółki w Almerii w Hiszpanii. Jako pierwotne eksplantaty zastosowano całe młode odrosty o średnicy 0,5–1 cm. Były to niewielkie rośliny mające już własny wierzchołek i areole. Ich późniejsze rozgałęzianie pozwalało mnożyć kultywar poprzez pąki boczne. [Lopez-Granero i wsp. 2023, s. 760–761]

Pożywka, światło i znaczenie konkretnego etapu

Kultura wegetatywna była prowadzona na MS z witaminami, w 25 ± 1°C, przy szesnastu godzinach światła i ośmiu godzinach ciemności. Lampy dostarczały 45 µmol fotonów/m²/s w zakresie fotosyntetycznie czynnego promieniowania 400–700 nm. W każdym wariancie użyto 35 eksplantatów, a doświadczenia powtarzano trzykrotnie. Badano osobno utrzymanie pędów, pobudzanie odrostów i tworzenie korzeni. [Lopez-Granero i wsp. 2023, s. 761–763]

Tabela 1 pracy określa pożywkę do utrzymania pędów jako MS z NAA 0,5 mg/l, kinetyną 0,3 mg/l i sacharozą 20 g/l. Do pobudzania odrostów dodawano GA₃ 5 mg/l na trzy dni, a do ukorzeniania ancymidol 5 mg/l oraz mniejszą ilość sacharozy, 10 g/l. Abstrakt podaje inne stężenie NAA, ilość cukru i numerację pożywek. Poniższe zestawienie odwzorowuje tabelę 1 oraz opis wyników, w których pożywki noszą oznaczenia MSM-1, MSM-2 i MSM-3. [Lopez-Granero i wsp. 2023, s. 759, 763–766, tab. 1]

NAA jest auksyną, kinetyna cytokininą, a GA₃ kwasem giberelinowym. Ich połączenie w tym materiale miało odmienne skutki niż podanie samej auksyny lub cytokiny. Autorzy odrzucali warianty, które wytwarzały dużo kalusu i nabrzmiałych tkanek. W ocenie materiału do dalszego mnożenia znaczenie miały więc liczba odrostów, wzrost, korzenie i zachowanie właściwej postaci pędów. [Lopez-Granero i wsp. 2023, s. 762–765, tab. 2–4]

Krótki impuls GA₃ i wiele nowych odrostów

Do wydajnego pobudzania odrostów wykorzystano duże eksplantaty długości 3–4 cm i szerokości co najmniej 1 cm. Pędy musiały wcześniej urosnąć, aby mieć dostatecznie wiele areol zdolnych do rozgałęziania. Po trzydniowym traktowaniu GA₃ 5 mg/l wszystkie badane eksplantaty tworzyły odrosty. Po ośmiu tygodniach wynosiło to średnio 34,9 ± 5,9 odrostu na eksplantat, przy podanym w wynikach zakresie 28–46. Abstrakt opisuje ten rezultat jako osiągany w sześć do siedmiu tygodni. [Lopez-Granero i wsp. 2023, s. 759, 761, 765, tab. 5]

Wyższa testowana dawka GA₃, 10 mg/l, również pobudzała odrosty na wszystkich eksplantatach, ale ich średnia liczba wynosiła 13,3 ± 5,6. Przy 1 mg/l odrosty wytwarzało 40 ± 2% eksplantatów, a bez GA₃ 4 ± 2%. Ocena skuteczności obejmuje więc liczbę odrostów oraz odsetek reagujących eksplantatów. Wariant 5 mg/l łączył wysoką liczbę odrostów z odpowiedzią wszystkich badanych eksplantatów. Rozwijające się odrosty pokrywały powierzchnię rośliny wyjściowej. Po ich oddzieleniu mogła ona wytwarzać dalsze partie. [Lopez-Granero i wsp. 2023, s. 761, 765, tab. 5]

Autorzy określają główną drogę namnażania jako bezpośrednie uruchamianie pąków związanych z areolami. W tabeli dla najlepszego wariantu odnotowano jednak także kalus u około 10% eksplantatów. Jego sporadyczne współwystępowanie odróżniono od regeneracji nowych roślin poprzez kalus. Praca nie przedstawia badań molekularnych całego otrzymanego potomstwa, więc zachowanie wyglądu kultywaru opisuje kontrolę fenotypu, a nie dowód identyczności wszystkich sekwencji DNA. [Lopez-Granero i wsp. 2023, s. 761, 765, 767–769]

Ukorzenienie i wyjście z kultury

Najwyższy odsetek ukorzenienia uzyskano na MSM-3 z ancymidolem. Wariant 5 mg/l dał 100% ukorzenionych pędów, podczas gdy kontrola w tabeli 7 dawała 40 ± 6%. Efekt sprawdzono dla pędów długości 1, 3 i 6 cm. Ancymidol hamuje biosyntezę giberelin. W doświadczeniu ograniczał wydłużanie części nadziemnej i wspomagał tworzenie systemu korzeniowego. [Lopez-Granero i wsp. 2023, s. 766, 768, tab. 7]

Rośliny z rozwiniętymi korzeniami przenoszono do odkażonej mieszaniny piasku, torfu i perlitu. Wilgotność względna powietrza była stopniowo obniżana z 80% do 60%, a następnie 50%, przy dalszym przesadzaniu do większych pojemników. W wynikach podano 100% przeżycia po dwóch miesiącach aklimatyzacji. Metody obejmują natomiast czteromiesięczny przebieg i ocenę po tym okresie. Ten szczegół pozostaje rozbieżnością czasu oceny w publikacji. Osiągnięte przeżycie odnosi się do uprzednio ukorzenionych roślin. [Lopez-Granero i wsp. 2023, s. 762, 766]

Kwiaty wymagają innego przygotowania

Do doświadczeń kwitnienia wybierano duże rośliny długości 4–6 cm. Przed zastosowaniem regulatorów poddawano je okresowi ograniczonej dostępności składników pożywki, nocnego chłodu 4–6°C i zmian długości dnia. W fazach światła temperatura wynosiła 25°C. Dla tego etapu podano strumień fotonów 450 µmol/m²/s, dziesięciokrotnie większy niż w kulturze wegetatywnej. Samo przygotowanie chłodem, pożywką i fotoperiodem nie doprowadziło do inicjacji kwiatów w opisanych próbach. [Lopez-Granero i wsp. 2023, s. 761–762, 766–767]

Po przygotowaniu zastosowano paklobutrazol, kolejny inhibitor biosyntezy giberelin. Przy 1 mg/l inicjację kwiatów stwierdzono u 66 ± 6% eksplantatów. W tabeli 8 średnia liczba kwiatów na eksplantat wynosiła 1,40 ± 0,16. Dalsze zwiększanie dawki do 3 i 5 mg/l wiązało się ze spadkiem odsetka inicjacji do 21 ± 5% oraz 11 ± 4%. W kontroli i przy 0,3 oraz 0,5 mg/l kwiatów nie odnotowano. [Lopez-Granero i wsp. 2023, s. 767, tab. 8]

Tabela 8 opisuje odczyt po sześciu tygodniach, metody wspominają osiem tygodni, a abstrakt miesiąc traktowania i dalsze przeniesienie. Różnią się też długości przygotowania chłodem oraz kolejnych faz fotoperiodu. Wynik wskazuje skuteczny wariant u wcześniej przygotowanego kultywaru. Pełne odtworzenie kalendarza doświadczenia wymaga wyjaśnienia tych rozbieżności, dlatego nie zapisano go jako jednolitej recepty o pewnym czasie trwania. [Lopez-Granero i wsp. 2023, s. 759, 761–762, 766–767]

Regulacja rozwoju i zakres doświadczenia

Jedna kombinacja regulatorów pobudzała odrosty, inna wspomagała ukorzenienie, a kwitnienie wymagało osobnego przygotowania i traktowania. Autorzy wiążą te rezultaty z kontrolą dominacji wierzchołkowej oraz równowagą regulatorów wzrostu. Szczegółowe wyjaśnienie kwitnienia poprzez zmiany endogennych hormonów pozostaje ich hipotezą, ponieważ stężeń tych hormonów nie mierzono w przedstawionej próbie. [Lopez-Granero i wsp. 2023, s. 767–769]

Parametry dotyczą kultur tkankowych określonego kultywaru. Pożywka z cukrem, aseptyczne naczynie, kontrolowany fotoperiod i wielkość eksplantatu są częścią warunków wyniku. Rozwinięte odrosty oraz uzyskane kwiaty pokazują możliwość kierowania różnymi etapami rozwoju tej rośliny w laboratorium. Odtwarzanie takich procesów wymaga zarazem rozdzielenia produkcji pędów, ukorzenienia i kwitnienia przy analizie danych. [Lopez-Granero i wsp. 2023, s. 761–769]