Mammillaria in vitro. Regeneracja, CAM i budowa cierni

Wycinek pędu zachowuje zdolność odrostu

W pracy Lázaro-Castellanos i współautorów z 2018 r. porównano Mammillaria hernandezii, M. dixanthocentron i M. supertexta (w publikacji M. lanata). Plants of the World Online przyjmuje obecnie pierwsze dwie nazwy i włącza M. lanata do synonimów M. supertexta. Trzecia grupa zachowała w doświadczeniu własną tożsamość materiału i osobne wyniki. [Lázaro-Castellanos i wsp. 2018, s. 519–521; POWO, 11 października 2026][2-WWW][2-WWW][2-WWW]

Materiał rozpoczęto z nasion Ogrodu Botanicznego UNAM. Siewki około 10 mm wysokości uzyskiwano po dwunastu miesiącach u M. hernandezii, ośmiu u M. dixanthocentron i sześciu w grupie lanata. Utrzymywano je na MS z 30 g/l sacharozy i 0,8% agaru, przy 25 ± 1°C, szesnastogodzinnym dniu i 55 µmol fotonów/m²/s. Aby zgromadzić materiał do porównań, przed doświadczeniem właściwym wykonano wstępne namnażanie z metatopoliną. [Lázaro-Castellanos i wsp. 2018, s. 519–521]

Pędy dzielono na części wierzchołkowe, podstawowe i boczne. Nowe pędy powstawały na wycinkach wierzchołkowych i bocznych, przede wszystkim z pobudzonych merystemów pachwinowych, czyli zachowanych stref zdolnych do tworzenia odrostu. Na częściach podstawowych tej odpowiedzi nie uzyskano. Metody przewidywały po cztery słoje dla wycinków wierzchołkowych i podstawowych oraz po osiem dla bocznych na wariant, z dwoma wycinkami w słoju. Położenie wycinka określało dostęp do struktur zdolnych do odrostu i dalszą reakcję na pożywkę. [Lázaro-Castellanos i wsp. 2018, s. 520–524, tab. 2–4]

Wydajność namnażania i obecność kalusa

Autorzy porównali benzyladeninę, kinetynę, metatopolinę i tidiazuron. Dla bocznych wycinków M. hernandezii metatopolina 2,2 µM dawała średnio 7,4 ± 1,1 pędu na eksplantat, przy kalusie na 12,5 ± 6,5% wycinków. U M. dixanthocentron metatopolina 1,1 µM dawała 16,7 ± 0,4 pędu i kalus na 80,0 ± 3,1% wycinków. Materiał lanata przy 1,1 µM tworzył 17,9 ± 1,0 pędu, z kalusem na 75,0 ± 4,8% wycinków. Są to średnie i błędy standardowe odrębnych grup doświadczalnych. [Lázaro-Castellanos i wsp. 2018, s. 522–525, tab. 2–4]

Kalus stanowi namnażającą się tkankę o zmienionej organizacji. W tych doświadczeniach pojawiał się obok odrostów pochodzących z zachowanych merystemów. Wysoka wydajność metatopoliny u dwóch grup współistniała z dużą częstością kalusa. Odrostowi pachwinowemu towarzyszyło więc namnażanie kalusa. Przy tidiazuronie częstość kalusa i objawy hiperhydryczności były większe. [Lázaro-Castellanos i wsp. 2018, s. 522–527]

Boczne wycinki M. dixanthocentron tworzyły średnio 14,2 ± 2,1 pędu także bez dodanych regulatorów, wobec 16,7 ± 0,4 przy wybranym stężeniu metatopoliny. W tej grupie zachowana zdolność odrostu była więc wysoka już w kontroli. Dla M. hernandezii średnia kontrolna wynosiła 2,5 ± 0,9, a dla materiału lanata 5,6 ± 0,9 pędu. Dobór regulatora miał różne znaczenie w trzech grupach. [Lázaro-Castellanos i wsp. 2018, s. 522–525, tab. 2–4]

Czas oceny wyników opisano w publikacji niespójnie. Metody wymieniają cztery tygodnie z cytokininą, cztery tygodnie na MS z węglem aktywnym i kolejne osiem tygodni na świeżym MS, łącznie szesnaście. Podpisy tabel 2–4 podają dwanaście tygodni. Średnie w tabelach odnoszą się do wskazanych wariantów, z rozbieżnie opisanym czasem oceny. [Lázaro-Castellanos i wsp. 2018, s. 520–524, Metody i podpisy tab. 2–4]

Ukorzenione pędy i rośliny po aklimatyzacji

Oddzielone pędy ukorzeniano na MS bez regulatorów wzrostu. Podano 98,4% ukorzenienia po ośmiu tygodniach u M. hernandezii, 94% po dwunastu tygodniach u M. dixanthocentron i 94,6% po dziesięciu tygodniach w grupie lanata. To wyniki etapu korzenienia, odrębnego od liczby odrostów i od późniejszego przeżycia poza naczyniem. [Lázaro-Castellanos i wsp. 2018, s. 523–525]

Ukorzenione rośliny około 10 mm wysokości przenoszono do ziemi ogrodowej i pumeksu 1:1. W szklarni było około 30°C. Pierwszy miesiąc pod osłoną utrzymywał 80–90% wilgotności względnej, a potem stopniowo przechodzono do 50–60%. Autorzy podali przeżycie przekraczające 95% dla badanych grup. Po dwunastu miesiącach w szklarni kwitło 80% opisywanych M. hernandezii. U pozostałych dwóch grup kwitnienie opisano po dwudziestu czterech miesiącach. Wiek liczony od przeniesienia do szklarni następował po wcześniejszym rozwoju siewek i kulturze pędów. [Lázaro-Castellanos i wsp. 2018, s. 520–521, 523–525]

Markery SSR sprawdzają wybrane miejsca genomu

Przez trzy kolejne cykle namnażania w ciągu dwóch lat badano podobieństwo materiału wyjściowego i pędów potomnych. Do analiz wybrano dziesięć roślin wyjściowych każdej grupy i próbki pędów z kolejnych cykli. Spośród dziewięciu par starterów uzyskano powtarzalne wyniki dla siedmiu loci u M. hernandezii i ośmiu u dwóch pozostałych grup. Markery SSR analizują różnice długości krótkich powtórzeń DNA w wybranych miejscach genomu. [Lázaro-Castellanos i wsp. 2018, s. 521, 525–526]

Porównania wskazały wysokie podobieństwo potomnych pędów do materiału wyjściowego, a równocześnie wykazały różnice w części markerów. Średni PIC, wskaźnik informacyjności polimorficznego markera, wynosił w kolejnych cyklach 0,04, 0,02 i 0,04 u M. hernandezii. U M. dixanthocentron wynosił 0,10, 0,15 i 0,13, a w grupie lanata 0,15, 0,12 i 0,08. PIC jest bezwymiarowym wskaźnikiem zróżnicowania alleli w badanym zestawie markerów. [Lázaro-Castellanos i wsp. 2018, s. 525–528, tab. 6]

Panel SSR określa podobieństwo namnażanego materiału w siedmiu lub ośmiu badanych loci DNA. Organizację pędu i jego metabolizm oceniano innymi metodami, w odrębnych doświadczeniach na materiale Mammillaria vetula. [Lázaro-Castellanos i wsp. 2018, Lázaro-Castellanos i wsp., s. 525–528; Balen i wsp., s. 1884–1891; POWO, 11 października 2026][Balen i wsp. 2012, Lázaro-Castellanos i wsp., s. 525–528; Balen i wsp., s. 1884–1891; POWO, 11 października 2026][2-WWW]

Rytm CAM w pędach i zmienionych tkankach

Balen i współautorzy użyli Mammillaria vetula (w publikacji M. gracilis). Porównali pięć typów materiału: rośliny doniczkowe, prawidłowe pędy in vitro, spontaniczny kalus rosnący bez dodanych hormonów, hiperhydryczne pędy z tego kalusa i linię tkanki nowotworowej wywołanej przez Agrobacterium tumefaciens. Ostatnia grupa miała określone pochodzenie infekcyjne i nie tworzyła prawidłowych organów. Hiperhydryczność oznaczała nadmierne uwodnienie i zmienioną budowę pędu. Pochodzenie linii określono na poziomie historycznej nazwy gatunkowej M. gracilis. [Balen i wsp. 2012, s. 1884–1886; POWO, 11 października 2026][2-WWW]

Kultury rosły na MS z 3% sacharozy i 0,9% agaru, bez regulatorów wzrostu, w 24°C przez całą dobę. Dzień trwał szesnaście godzin, przy 90 µmol fotonów/m²/s. Rośliny doniczkowe pozostawały w tych samych warunkach światła i temperatury. Do pomiarów pobierano kultury dwa tygodnie po pasażu i jednoroczne pędy z doniczek. Każdy pomiar obejmował sześć roślin lub kolb, a doświadczenia powtarzano podczas co najmniej dwóch zbiorów materiału. [Balen i wsp. 2012, s. 1884–1886]

CAM wiąże nocne wiązanie węgla z gromadzeniem kwasów organicznych i ich późniejszym wykorzystaniem w dzień. W tym badaniu normalne pędy in vitro zachowały wyższą kwasowość na końcu nocy niż po ośmiu godzinach dnia. Różnica była mniejsza niż u roślin doniczkowych, ponieważ podczas dnia pozostawała wysoka kwasowość. Kalus, pędy hiperhydryczne i tkanka nowotworowa nie wykazały istotnej dobowej różnicy kwasowości. [Balen i wsp. 2012, s. 1883–1884, 1887–1889, ryc. 2]

We wszystkich typach materiału wykrywano aktywność PEPC, karboksylazy fosfoenolopirogronianowej uczestniczącej w pierwszym etapie wiązania węgla CAM. Najniższą aktywność mierzono na końcu nocy, a najwyższą dwie godziny po rozpoczęciu ciemności. Kalus, pędy hiperhydryczne i tkanka nowotworowa miały wtedy większą aktywność enzymu niż normalne pędy in vitro, przy braku istotnego nocnego przyrostu kwasowości. Badanie zestawiało więc aktywność enzymu z wynikiem jego działania w postaci dobowej zmiany kwasowości. Ocenę CAM oparto na tych pomiarach biochemicznych i fluorescencji, w zakresie metabolizmu badanych tkanek. [Balen i wsp. 2012, s. 1887–1891, ryc. 2–5]

Fluorescencja i mikroskopowa budowa cierni

Maksymalną wydajność fotochemiczną fotosystemu II mierzono przez fluorescencję chlorofilu, jako stosunek Fv/Fm. Średnie wynosiły 0,786 u roślin doniczkowych, 0,730 u normalnych pędów in vitro, 0,640 w kalusie, 0,686 w pędach hiperhydrycznych i 0,466 w tkance nowotworowej. Wskaźnik ten opisuje maksymalną wydajność fotochemiczną fotosystemu II. Fluorescencja, kwasowość i aktywność enzymu określają różne cechy działania aparatu fotosyntetycznego. [Balen i wsp. 2012, s. 1885–1887, tab. 2]

Peharec i współautorzy w odrębnej pracy z 2010 r. porównali ciernie tego historycznie oznaczonego materiału M. gracilis. Rośliny szklarniowe pochodziły z ukorzenionych i aklimatyzowanych normalnych pędów in vitro, a następnie rosły w szklarni przez pięć lat. Zestawiono je z prawidłowymi oraz hiperhydrycznymi pędami w kulturze. Skaningowa mikroskopia elektronowa objęła po siedemnaście cierni każdego typu. Liczebność próby podano dla cierni. Liczba roślin dostarczających materiał pozostała w pracy nieokreślona. [Peharec i wsp. 2010, s. 79–80]

Średnia długość ciernia z błędem standardowym wynosiła 6,18 ± 0,17 mm u roślin szklarniowych, 2,48 ± 0,02 mm u prawidłowych pędów in vitro i 1,31 ± 0,02 mm u pędów hiperhydrycznych. Powierzchnia cierni szklarniowych miała drobne uwypuklenia epidermy. U obu typów kultury komórki tej warstwy tworzyły dłuższe włoskowate wyrostki. Różnica występowała zatem również na pędach uznanych za prawidłowe. [Peharec i wsp. 2010, s. 80–84, ryc. 3–5]

Hiperhydryczne pędy były przezroczystawe i obrzmiałe, ze słabo wyodrębnionymi brodawkami oraz zaburzonym ułożeniem cierni. Porównanie dokumentowało budowę w różnych warunkach i przy różnym wieku materiału. Czynniki te zmieniały się łącznie, a zakres pomiarów obejmował morfologię pędu i cierni. W zestawieniu z fluorescencją i kwasowością mikroskopia rozwija opis cech materiału uzyskiwanego w kulturze. [Peharec i wsp. 2010, Peharec i wsp., s. 80–85; Balen i wsp., s. 1887–1891; Lázaro-Castellanos i wsp., s. 525–528][Balen i wsp. 2012, Peharec i wsp., s. 80–85; Balen i wsp., s. 1887–1891; Lázaro-Castellanos i wsp., s. 525–528][Lázaro-Castellanos i wsp. 2018, Peharec i wsp., s. 80–85; Balen i wsp., s. 1887–1891; Lázaro-Castellanos i wsp., s. 525–528]