Pelecyphora in vitro. Od areoli do mikroszczepienia

Mały pęd, wiele czynnych areoli

Areola zawiera merystem, tkankę zdolną do tworzenia nowych organów. W kulturze fragment pędu z zachowanymi areolami może stać się początkiem kolejnych roślin. Dla wolno rosnących Pelecyphora aselliformis i P. strobiliformis wykorzystano tę właściwość w doświadczeniu opublikowanym w 2002 r. Eksplantatem, czyli fragmentem rośliny umieszczonym w kulturze, był wierzchołek siewki albo odcinek poprzeczny bez wierzchołka. Nowe pędy rozwijały się z istniejących areoli. [Pérez-Molphe-Balch i Dávila-Figueroa 2002, s. 73–76]

Obie rośliny należały wtedy do dwugatunkowego Pelecyphora. Gatunek o szyszkowatym korpusie jest znany także jako Encephalocarpus strobiliformis. Obecny POWO przyjmuje szeroki rodzaj z gatunkami dawnego Escobaria. Opisane tu wartości pozostają wynikami dwóch oznaczonych gatunków i konkretnego materiału rozmnożeniowego. [Sánchez i wsp. 2022, Sánchez i wsp., s. 129–145. POWO, stan 11 października 2026][2-WWW][2-WWW]

Siewki w kontrolowanym środowisku

Pérez-Molphe-Balch i Dávila-Figueroa zaczęli od nasion otrzymanych z dwóch klonów każdego gatunku. Dostępnych było mniej niż sto nasion P. aselliformis oraz mniej niż sto P. strobiliformis. Około połowa wykiełkowała w sterylnych warunkach. Pożywka MS, nazwana od Murashigego i Skooga, dostarczała mineralnych składników pokarmowych. Do kiełkowania zawierała 30 g/L sacharozy i 8 g/L agaru, przy pH 5,7. Sacharoza stanowiła źródło węgla, a agar nadawał pożywce stałą konsystencję. [Pérez-Molphe-Balch i Dávila-Figueroa 2002, s. 73–74]

Temperatura wynosiła 25 ± 2°C. Fotoperiod obejmował 16 godzin światła i osiem godzin ciemności, przy strumieniu fotonów fotosyntetycznych 54 µmol m⁻² s⁻¹. Te same podstawowe warunki komory utrzymywano w dalszych etapach. Wstępne namnażanie dostarczyło pędów długości 20–25 mm, z których otrzymywano fragmenty wierzchołkowe oraz krążki poprzeczne grubości 4 mm. Właściwe porównanie namnażania miało dwa stężenia sacharozy, 30 i 50 g/L, oraz różne stężenia cytokinin. Pożywkę zestalało w tej fazie 10 g/L agaru. [Pérez-Molphe-Balch i Dávila-Figueroa 2002, s. 74]

Cytokinina, dominacja wierzchołkowa i kolejne cykle

Benzyladenina, BA, jest cytokininą stosowaną do pobudzania tworzenia pędów. W badaniu z 2002 r. fragmenty z wierzchołkiem rozwijały duży pęd główny oraz mniejsze pędy u podstawy. Krążki bez wierzchołka dawały bardziej wyrównane pędy. Autorzy wiązali tę różnicę z dominacją wierzchołkową, wpływem aktywnego wierzchołka na wzrost innych merystemów. Przy ocenie wydajności znaczenie miał więc zarówno skład pożywki, jak i położenie pobranego fragmentu. [Pérez-Molphe-Balch i Dávila-Figueroa 2002, s. 75–76]

Pierwszy cykl trwał 60 dni. Następnie pędy przenoszono na świeżą pożywkę i powtarzano namnażanie. Zestawienie po 180 dniach odnosiło liczbę otrzymanych pędów do początkowego eksplantatu. Taka wartość opisuje skumulowany wynik trzech cykli. Poszczególne cytokininowe warianty porównywano przy 20–30 eksplantatach każdego typu i dwóch niezależnych doświadczeniach dla gatunku. Dalsze cykle trzech wybranych wariantów prowadzono z materiału wywodzącego się z 15 eksplantatów początkowych na wariant. [Pérez-Molphe-Balch i Dávila-Figueroa 2002, s. 74–75]

Największy wynik pierwszego cyklu i największy wynik po trzech cyklach mogą pochodzić z różnych wariantów. U P. strobiliformis większą początkową liczbę pędów otrzymano z krążków, natomiast największą liczbę po 180 dniach z fragmentów wierzchołkowych na innym stężeniu sacharozy. W abstrakcie tej pracy wariant dający 12,37 pędu przypisano BA 8,8 µM. Tabela 2 lokuje ten wynik przy BA 4,4 µM. Powyższe zestawienie zachowuje wartości i warunki z tabeli, wraz z tą rozbieżnością w publikacji. [Pérez-Molphe-Balch i Dávila-Figueroa 2002, s. 73, 75, tab. 2]

Od małego pędu do rośliny z korzeniami

Pędy po intensywnym namnażaniu wymagały wydłużenia. Po 60 dniach na MS z 3 g/L węgla aktywnego średnia długość P. aselliformis wynosiła 12 ± 0,29 mm, a P. strobiliformis 15 ± 0,37 mm. W kontroli MS wartości wynosiły odpowiednio 10 ± 0,24 i 11 ± 0,21 mm. Autorzy rozważali adsorpcję pozostałych regulatorów przez węgiel jako możliwe wyjaśnienie. Składu hormonów w pędach ani ich związania przez węgiel nie oznaczali w tym doświadczeniu. [Pérez-Molphe-Balch i Dávila-Figueroa 2002, s. 77, tab. 3]

Ukorzenianie prowadzono oddzielnie na MS z dodatkiem kwasu indolilooctowego, IAA, albo indolilomasłowego, IBA. Oba są auksynami stosowanymi w indukowaniu korzeni. Po sześciu tygodniach oceniano pędy, których korzenie osiągnęły co najmniej 15 mm. Wspólnie dla zastosowanych wariantów było to 89% pędów P. aselliformis i 87% P. strobiliformis. Po przeniesieniu do mieszaniny piasku i gleby 1:1 rośliny przez dwa do trzech tygodni pozostawały pod wilgotną osłoną, następnie w szklarni. Po 16 tygodniach przeżycie połączonego materiału obu gatunków wynosiło 88%. [Pérez-Molphe-Balch i Dávila-Figueroa 2002, s. 74, 77–78]

Namnażanie, ukorzenienie i przeżycie po przeniesieniu poza kulturę są kolejnymi etapami. Ich procenty mają różne mianowniki. Wysoka liczba uzyskanych pędów opisuje pierwszy etap, a dalszy wynik zależy także od rozwinięcia korzeni i dostosowania rośliny do nowego środowiska. W tej pracy hiperhydryczność, nadmierne uwodnienie i szklisty wygląd tkanek, pojawiała się u mniej niż 5% otrzymanych pędów. [Pérez-Molphe-Balch i Dávila-Figueroa 2002, s. 77–78]

Mikroszczepienie na Opuntia ficus-indica

Badalamenti i współautorzy w 2016 r. wykorzystali żywą podkładkę jako środowisko wzrostu małego zrazu P. aselliformis. Materiał siewny obejmował 45 nasion tego gatunku oraz 60 nasion Opuntia ficus-indica. W warunkach doświadczenia wykiełkowało odpowiednio 73,3 i 75%. Do mikroszczepienia pobierano dwa rodzaje zrazów, 5-milimetrowy wierzchołek i 3-milimetrowy odcinek podwierzchołkowy z co najmniej jedną areolą. Fragmenty opuncji miały 10 mm długości i początkowo były pozbawione korzeni. Najlepsze wyniki w próbach wstępnych dawała średnica podkładki 4–6 mm. [Badalamenti i wsp. 2016, s. 2–3]

Kultury utrzymywano przy 25 ± 1°C, 16 godzinach światła na dobę i strumieniu fotonów 50 µmol m⁻² s⁻¹. Produkcja podkładek obejmowała wcześniej pożywkę z 2 µM BA. Sam etap mikroszczepienia prowadzono na MS bez dodanych regulatorów wzrostu. W opisie metody pozostają zatem dwa osobne etapy o innym składzie pożywki. [Badalamenti i wsp. 2016, s. 2–3]

1. Ze sterylnych siewek i kultur otrzymywano odpowiednio duże zrazy oraz świeże fragmenty podkładki. Zachowywano areole na odcinkach podwierzchołkowych.
2. Świeżo przecięty zraz przykładano do świeżo przeciętej podkładki w warunkach aseptycznych. Oba fragmenty trafiały na pożywkę do dalszego wzrostu i tworzenia korzeni podkładki.
3. Pędy odrastające z areoli opuncji usuwano okresowo. Wzrost zrazu oceniano po trzech i sześciu tygodniach, a obecność żywych zrazów i nowych pędów po 60 dniach.
4. Rozwinięte mikroszczepy przenoszono do sterylizowanych krążków torfowych Jiffy. Początkowo utrzymywano wilgotność względną 95 ± 5%, do wyrośnięcia korzeni poza krążek.
5. Następnie rośliny trafiały do szklarni o temperaturze 25 ± 2°C w dzień i 20 ± 2°C w nocy. Przeżycie sprawdzano po dwóch miesiącach od przeniesienia poza kulturę.

Przebieg przedstawia procedurę laboratoryjną opublikowanego doświadczenia. Materiał podwierzchołkowy dawał więcej fragmentów z jednej siewki, ponieważ każdy zachowany odcinek z areolą mógł rozpocząć wzrost. [Badalamenti i wsp. 2016, s. 2–3]

Wierzchołek i odcinek z areolą dają różne wyniki

Wierzchołek częściej zachowywał żywotność i podejmował wzrost. Odcinek podwierzchołkowy miał niższy odsetek przyjęć, lecz pozwalał otrzymać większą liczbę pędów z areoli. U części nieudanych szczepień obserwowano przesunięcie zrazu. Sposób wykorzystania siewki określał więc jednocześnie liczbę możliwych zabiegów, ich powodzenie oraz dalsze namnażanie. [Badalamenti i wsp. 2016, s. 3–4, tab. 1]

Po sześciu tygodniach 90% przyjętych mikroszczepów miało korzenie. Po przeniesieniu poza kulturę 85 ± 0,8% roślin przeżyło do oceny po dwóch miesiącach. W tabeli te dwa wyniki podano wspólnie, bez odrębnego przypisania do każdego typu zrazu. Badanie dokumentuje zatem zakończenie określonej sekwencji rozmnażania i aklimatyzacji, wraz z jej czasem obserwacji. [Badalamenti i wsp. 2016, s. 3–4, tab. 1]

Materiał do kolekcji i badań nad ochroną

Pobudzanie istniejących areoli umożliwia namnażanie pędów, a siew zachowuje zróżnicowanie między nowymi osobnikami. W doświadczeniu z 2002 r. materiał nasienny pochodził tylko z dwóch klonów każdego gatunku. Wielka liczba wyprowadzonych pędów nie określa więc wielkości reprezentowanej puli genetycznej. Dla zachowania zmienności znaczenie ma liczba i pochodzenie roślin wyjściowych, obok skuteczności samej techniki. To wniosek z zakresu materiału użytego w badaniu. [Pérez-Molphe-Balch i Dávila-Figueroa 2002, s. 73–74]

Przegląd dotyczący P. chihuahuensis z 2026 r. omawia krioprezerwację, czyli przechowywanie w bardzo niskiej temperaturze, oraz przyszłe zastosowania narzędzi genomowych. Przykłady kultur i przechowywania nasion pochodzą tam głównie z innych kaktusów. Dla P. chihuahuensis edycję genów autorzy określają wprost jako kierunek hipotetyczny. Sprawdzone procedury dwóch klasycznych Pelecyphora stanowią konkretną podstawę do planowania prób dla następnych gatunków, z osobnym określeniem ich reakcji. [Loweree-Rivera i wsp. 2026, s. 10–14, 20]