Ograniczony wzrost pierwszego korzenia
Pierwszy korzeń siewki rozwija się z korzonka zarodkowego i tworzy początkową oś podziemnej części rośliny. Jego wydłużanie zależy od wytwarzania nowych komórek w merystemie wierzchołkowym oraz późniejszego zwiększania ich długości. Merystem jest obszarem zachowującym zdolność do podziałów. Wraz z rozwojem komórki opuszczają ten obszar, powiększają się i uzyskują cechy właściwe poszczególnym tkankom. U Pachycereus pringlei stopniowe różnicowanie obejmuje z czasem także sam wierzchołek korzenia głównego. [Dubrovsky i Gómez-Lomelí 2003] [Rodriguez-Alonso i wsp. 2018]
Taki przebieg określa się jako wzrost determinowany. Oznacza on ograniczony okres aktywności danego wierzchołka, po którym ustaje dalsze wydłużanie tej osi. Los pojedynczego korzenia trzeba przy tym odnieść do organizacji całej rośliny. Siewka wytwarza korzenie boczne, które tworzą nowe powierzchnie kontaktu z podłożem. Rozwój systemu korzeniowego może więc postępować równocześnie z kończeniem wzrostu jego pierwszej osi. Ta różnica skali jest szczególnie istotna przy porównywaniu młodej siewki z dużym, wieloletnim kaktusem. [Dubrovsky i Gómez-Lomelí 2003]
Woda jako czynnik zmieniający tempo rozwoju
Dubrovsky i Gómez-Lomelí badali w 2003 roku siewki pochodzące z nasion zebranych w pobliżu La Paz w Meksyku. Rośliny rosły na pożywce agarowej w pionowo ustawionych szalkach. Położenie wierzchołka zaznaczano codziennie, co pozwalało śledzić przyrost tego samego korzenia. Do części pożywek wprowadzono glikol polietylenowy, który obniżał potencjał wody. W takich warunkach woda staje się trudniej dostępna dla tkanek. Zestawienie kilku wariantów umożliwiło oddzielenie wpływu umiarkowanego i silnego deficytu od samego upływu czasu. [Dubrovsky i Gómez-Lomelí 2003]
Korzeń kończył wzrost we wszystkich badanych wariantach. Silny deficyt wody przyspieszał ten moment i zmniejszał tempo wydłużania. Umiarkowane obniżenie potencjału dawało znacznie słabszą odpowiedź, a końcowa długość korzenia mogła pozostawać zbliżona do kontroli. W jednym porównaniu przeciętny okres wzrostu wynosił około ośmiu dni w kontroli i przy umiarkowanym deficycie, natomiast około sześciu dni przy silnym stresie. Wynik odnosi się do konkretnych pożywek i warunków doświadczenia. Pokazuje zmianę tempa programu rozwojowego w odpowiedzi na dostępność wody. [Dubrovsky i Gómez-Lomelí 2003]
Komórki dzielą się i różnicują w zmieniających się proporcjach
Obserwacje mikroskopowe pozwoliły wskazać, co kryje się za zmianą długości korzenia. Obszar merystemu stopniowo się zmniejszał, a komórki o cechach dojrzałej skórki pojawiały się coraz bliżej wierzchołka. Widocznym wskaźnikiem były włośniki, czyli cienkie wypustki komórek skórki zwiększające powierzchnię kontaktu z otoczeniem. W końcowej fazie pokrywały także najbardziej szczytową część osi. Autorzy śledzili więc przemianę tkanek, korzystając z ich położenia i cech budowy, a nie wyłącznie z pomiaru całkowitej długości korzenia. [Dubrovsky i Gómez-Lomelí 2003]
Kurczenie się merystemu miało charakter stopniowy. Przez część obserwowanego okresu nadal występowały podziały, chociaż malała pula komórek zachowujących merystematyczny stan. Jednocześnie komórki powstałe wcześniej mogły jeszcze się wydłużać. Dlatego okres aktywnego wytwarzania komórek i okres zwiększania długości całego korzenia miały różne granice. Silny stres ograniczał zarówno produkcję komórek, jak i ich późniejsze wydłużanie. Odpowiedź korzenia obejmowała zatem dwa powiązane procesy, które badacze rozdzielili dzięki pomiarom na poziomie komórek i całego organu. [Dubrovsky i Gómez-Lomelí 2003]
Gęstsze rozgałęzienia na krótszej osi
Rozwój korzeni bocznych rozpoczynał się wcześnie, podczas wzrostu korzenia głównego. Badacze liczyli zarówno korzenie już widoczne na powierzchni, jak i ich zawiązki ukryte w tkankach. Przy silnym deficycie wody liczba tych struktur przypadająca na milimetr osi była większa. Łączna liczba korzeni i zawiązków na roślinę pozostawała jednak podobna w badanych wariantach. Zwiększona gęstość wynikała z rozmieszczenia porównywalnej liczby rozgałęzień na krótszym korzeniu. To rozróżnienie pozwala właściwie opisać zmianę architektury podziemnej części siewki. [Dubrovsky i Gómez-Lomelí 2003]
Wiele korzeni bocznych było bardzo krótkich i również wcześnie kończyło wzrost. Część tworzyła dalsze rozgałęzienia, a niektóre osie utrzymywały aktywność dłużej. Powstawał niewielki, rozgałęziony system o zróżnicowanych losach poszczególnych wierzchołków. Autorzy wiązali taką organizację z oszczędnym wykorzystaniem zasobów i możliwością pobierania wody podczas krótkich okresów jej dostępności. Jest to interpretacja znaczenia obserwowanej budowy. Doświadczenie mierzyło rozwój siewek w warunkach kontrolowanych, natomiast przewagę przeżycia w naturalnej populacji trzeba oceniać w badaniach terenowych. [Dubrovsky i Gómez-Lomelí 2003]
RNA pokazuje kolejne stany wierzchołka
W 2018 roku Rodriguez-Alonso i współpracownicy zbadali ten proces na poziomie transkryptomu, czyli zbioru cząsteczek RNA odzwierciedlających aktywność genów w pobranym materiale. Wyodrębnili trzy stadia wierzchołka korzenia Pachycereus pringlei. Pierwsze obejmowało aktywny merystem, kolejne jego zmniejszanie, a ostatnie wierzchołek z komórkami zróżnicowanymi. Siewki rosły na pożywce zapewniającej dostęp do wody. Porównanie dotyczyło zatem zmian zachodzących podczas rozwoju, a nie bezpośredniej odpowiedzi na narzucony epizod suszy. Materiał pobierano z milimetrowych odcinków wierzchołkowych. [Rodriguez-Alonso i wsp. 2018]
Dla każdego stadium przygotowano dwa powtórzenia biologiczne do sekwencjonowania RNA. Każde z nich obejmowało pulę wielu wierzchołków, dzięki czemu uzyskiwano materiał potrzebny do analizy. Odczyty połączono w sekwencje transkryptów bez korzystania z gotowego genomu referencyjnego tego gatunku. Tak powstały zbiór liczył 49045 sekwencji o długości co najmniej 400 nukleotydów. Liczba ta opisuje wynik składania transkryptomu. Poszczególne sekwencje mogą reprezentować warianty i fragmenty RNA, dlatego ich liczby nie utożsamia się bezpośrednio z liczbą genów rośliny. [Rodriguez-Alonso i wsp. 2018]
Różnicowanie zmienia profil ekspresji
Największe zmiany ekspresji wykrywano przy porównywaniu stadiów wcześniejszych ze stadium końcowym. Wierzchołek złożony z komórek zróżnicowanych miał inny profil RNA niż obszar zawierający komórki dzielące się i wydłużające. Badacze porównali te profile także z danymi dla stref korzenia Arabidopsis thaliana. Podobieństwo między końcowym stadium kaktusa a strefą różnicowania rzodkiewnika wspierało interpretację opartą na budowie tkanek. Analiza dotyczyła jednak mieszaniny komórek z całego pobranego odcinka, a więc zmiana ich proporcji również wpływała na odczytany profil ekspresji. [Rodriguez-Alonso i wsp. 2018]
W stadium końcowym większą reprezentację uzyskiwały między innymi transkrypty związane z odpowiedzią na stres i sygnalizacją kwasu abscysynowego. Ponieważ rośliny miały dostęp do wody, autorzy zaproponowali, że część programu kojarzonego z suszą jest uruchamiana podczas zwykłego rozwoju korzenia. To hipoteza dotycząca organizacji regulacji genów. Podobieństwo opisów funkcji transkryptów wskazuje kierunek dalszych doświadczeń, ale samo w sobie nie ustala, który regulator wywołuje zakończenie aktywności merystemu. Do takiego rozstrzygnięcia potrzebne są bezpośrednie manipulacje funkcją wybranych genów. [Rodriguez-Alonso i wsp. 2018]
Od podobieństwa sekwencji do sieci regulatorów
W sekwencjach kaktusa rozpoznano potencjalne odpowiedniki regulatorów merystemu znanych z Arabidopsis, w tym białek należących do grup PLETHORA, SCARECROW, SHORT-ROOT i WOX. Następnie zbudowano przewidywaną sieć zależności, przenosząc informacje o połączeniach z rośliny modelowej. Taka sieć porządkuje kandydatów do dalszych badań. Jej poszczególne połączenia mają status zależności wywnioskowanych przez porównanie. Aktywność podobnego transkryptu w dwóch gatunkach może współwystępować z różnicami miejsca działania, regulacji lub roli biologicznej kodowanego białka. [Rodriguez-Alonso i wsp. 2018]
Wybrane profile ekspresji sprawdzono dodatkowo metodą RT-qPCR, która mierzy względną ilość określonych RNA po ich przepisaniu na DNA. Dla dwunastu z trzynastu analizowanych genów uzyskano jakościowo zgodny kierunek zmian z wynikiem sekwencjonowania. Zgodność dwóch metod wzmacnia wiarygodność opisu ekspresji. Nadal pozostaje to pomiar ilości RNA, oddzielny od pomiaru ilości i aktywności białka. Połączenie danych mikroskopowych z transkryptomem daje przez to wielopoziomowy opis rozwoju korzenia, zachowując odrębność obserwowanego procesu i proponowanego mechanizmu jego regulacji. [Rodriguez-Alonso i wsp. 2018]
Dwa doświadczenia opisują różne poziomy procesu
Oba badania korzystały z nasion zebranych w różnych miejscach i z odmiennych pożywek. W doświadczeniu fizjologicznym porównano między innymi warianty z dodatkiem sacharozy, a do dalszych pomiarów wybrano warunki zmniejszające zmienność długości korzeni. W pracy transkryptomicznej nasiona pochodziły z okolic Bahía Kino, siewki rosły bez dodatku sacharozy, w temperaturze 28°C i przy dwunastogodzinnym dniu. Zestawienie wyników pozwala łączyć obserwacje komórkowe z profilem RNA. Konkretne dni rozwoju zachowują jednak znaczenie nadane im w każdym doświadczeniu. [Dubrovsky i Gómez-Lomelí 2003] [Rodriguez-Alonso i wsp. 2018]
Wyniki przedstawiają wczesną organizację korzeni, od pojawienia się korzonka do zróżnicowania jego wierzchołka. W tym krótkim okresie kształtują się osie i rozgałęzienia, które stanowią punkt wyjścia do dalszego rozwoju. Pierwsza praca pokazuje, jak dostępność wody zmienia przebieg tego etapu. Druga wskazuje grupy transkryptów i regulatorów towarzyszących kolejnym stanom komórek. Razem tworzą podstawę do dalszego badania zależności między różnicowaniem tkanek, rozgałęzianiem systemu i warunkami osiedlania siewek pustynnego kaktusa. [Dubrovsky i Gómez-Lomelí 2003] [Rodriguez-Alonso i wsp. 2018]
Water deficit accelerates determinate developmental program of the primary root and does not affect lateral root initiation in a Sonoran Desert cactus (Pachycereus pringlei, Cactaceae)
Dubrovsky J. G., Gómez-Lomelí L. F., Water deficit accelerates determinate developmental program of the primary root and does not affect lateral root initiation in a Sonoran Desert cactus (Pachycereus pringlei, Cactaceae), American Journal of Botany, 2003, 90(6):823-831, doi: 10.3732/ajb.90.6.823
Doświadczenia na siewkach Pachycereus pringlei opisują kończenie wzrostu korzenia głównego i wpływ deficytu wody na jego merystem. Pomiary komórek i rozgałęzień rozróżniają zmniejszenie wydłużania korzenia od inicjowania korzeni bocznych. Silny stres przyspiesza zakończenie wzrostu przy zachowanej liczbie zawiązków bocznych.
Transcriptomics insights into the genetic regulation of root apical meristem exhaustion and determinate primary root growth in Pachycereus pringlei (Cactaceae)
Rodriguez-Alonso G., Matvienko M., López-Valle M. L., Lázaro-Mixteco P. E., Napsucialy-Mendivil S., Dubrovsky J. G., Shishkova S., Transcriptomics insights into the genetic regulation of root apical meristem exhaustion and determinate primary root growth in Pachycereus pringlei (Cactaceae), Scientific Reports, 2018, 8:8529, doi: 10.1038/s41598-018-26897-1
Transkryptom wierzchołków korzeni Pachycereus pringlei porównano na trzech etapach rozwoju. Analiza wskazuje zmiany ekspresji towarzyszące różnicowaniu komórek oraz obecność potencjalnych regulatorów utrzymania merystemu. Sieć zależności wywnioskowano przez porównanie z Arabidopsis, a wybrane profile RNA sprawdzono metodą RT-qPCR.