Obregonia in vitro. Od areoli do samodzielnej rośliny

Z nasiona do materiału wyjściowego

Obregonia denegrii rośnie powoli z nasion, a w starszych opracowaniach wskazywano presję wykopywania okazów dla kolekcji i ograniczania siedlisk. Rozmnażanie w kulturze tkankowej pozwalało więc poszukiwać wydajniejszych dróg uzyskiwania nowych roślin. Eksplantem nazywa się fragment użyty do zapoczątkowania kultury. U tego gatunku mogła to być część siewki, brodawka z areolą albo tkanka zdolna do tworzenia kalusa, z którego rozwijały się dalsze struktury. [Cardarelli i wsp. 2010] [Malda i wsp. 1999b]

Cardarelli, Borgognone i Colla rozpoczęli badanie od nasion. W 25 ± 1°C i przy 16 godzinach światła około 40 µmol fotonów m⁻² s⁻¹ kiełkowanie na jałowej, wilgotnej bibule osiągnęło 72,7 ± 1,4% po 28 dniach. Próba obejmowała pięć powtórzeń po 25 nasion. W osobnej serii na stałej pożywce MS, z trzema powtórzeniami po 25 nasion, wcześniejsze moczenie w wodzie dawało 22,3 ± 1,0%, a zabieg GA₃ 85,2 ± 0,9% po siedmiu dniach. Rozproszenie podano jako odchylenie standardowe. Metody i tabela zapisują różne stężenia GA₃, więc porównanie dokumentuje efekt zabiegu bez ustalenia jednoznacznej dawki. [Cardarelli i wsp. 2010, s. 30, tabela 1 s. 32]

Pożywka MS dostarcza soli mineralnych. W tej serii zawierała także 30 g/l sacharozy jako dodatkowe źródło węgla i 9 g/l agaru tworzącego żel. Po czterech tygodniach siewki przenoszono na warianty z regulatorami wzrostu. Auksyny i cytokininy kształtują odpowiedź rozwojową tkanek. Zależnie od zastosowanego układu roślina może zwiększać rozmiar, tworzyć pędy, korzenie lub kalus. Wynik pojedynczego etapu określa tylko tę odpowiedź, którą faktycznie oceniono. [Cardarelli i wsp. 2010, s. 30–33]

Przecięcie pędu i aktywacja areoli

Z czteromiesięcznych roślin przygotowano pięć rodzajów eksplantów. Porównano całe fragmenty wierzchołkowe, podstawowe i korzeniowe, podłużnie dzielone wierzchołki oraz pojedyncze brodawki. Wspólna pożywka CM zawierała MS, 4,4 µM BAP, 10,7 µM NAA, sacharozę i agar. Po 45 dniach podłużnie dzielone wierzchołki tworzyły około 3,3 pędu na eksplant, a brodawki około jednego. Trzy pozostałe typy nie wykazywały proliferacji w tym etapie. [Cardarelli i wsp. 2010, s. 30–33]

Nowe pędy rozwijały się z areoli. Rozcięcie wierzchołka zmieniało układ wzrostu rośliny i według autorów ograniczało dominację wierzchołkową, sprzyjając aktywacji pąków bocznych. Porównanie całego i podłużnie dzielonego fragmentu wykazało znaczenie sposobu przygotowania materiału. Nie badano w nim stężenia hormonów wewnątrz areoli. Interpretacja anatomiczna opiera się na położeniu nowych pędów i reakcji na przecięcie. [Cardarelli i wsp. 2010, s. 32–33]

Dodatki do pożywki i jakość nowych pędów

W kolejnej serii pozostawiono dwa skuteczne typy eksplantów i porównano CM z trzema dodatkami. W każdym układzie doświadczalnym stosowano cztery powtórzenia po 24 eksplanty. Materiał przenoszono na świeżą pożywkę w kolejnych 45-dniowych pasażach. CPPU, syntetyczna cytokinina, zwiększyła liczbę pędów do 5,0 ± 0,4 na eksplant. Putrescyna, poliamina, dała 2,4 ± 0,6 i wiązała się z najwyższym odsetkiem spontanicznie ukorzenionych eksplantów. Azotan srebra dał liczbę pędów zbliżoną do CM. [Cardarelli i wsp. 2010, s. 31–34]

CM była już pożywką z BAP i NAA. Wszystkie trzy substancje oceniano zatem jako dodatki do tego układu. Symbol „—” zachowuje zapis braku danego zjawiska w tabeli źródłowej. Najwięcej pędów przy CPPU towarzyszyło także największemu udziałowi eksplantów z kalusem. Podczas pasaży autorzy usuwali kalus z powierzchni cięć, kierując dalszą kulturę na bezpośrednią aktywację areoli. Regeneracja z wcześniej istniejących merystemów i regeneracja przez kalus stanowią różne drogi rozwojowe. [Cardarelli i wsp. 2010, s. 33–34]

W tej serii hiperhydryczność dotyczyła średnio około 10–23% eksplantów zależnie od pożywki, a różnice między wariantami nie były istotne statystycznie. Zaburzenie nadmiernego uwodnienia tkanek należy więc uwzględniać równolegle z liczbą nowych pędów. W osobnym etapie wzrostu siewek pożywki z TDZ dawały więcej kalusa i hiperhydryczności niż warianty bez TDZ. Użyteczny wynik mikrorozmnażania obejmuje jakość tkanek i ich dalsze ukorzenienie. [Cardarelli i wsp. 2010, tabele 2–3, s. 33–34]

Zarodki powstające z tkanek wegetatywnych

W pracy Malda, Suzána i Backhausa z 1999 r. apikalne części dwumiesięcznych siewek O. denegrii wytwarzały pędy boczne, pędy przybyszowe i zarodki somatyczne. Zarodek somatyczny powstaje z tkanki wegetatywnej, bez zapłodnienia. Na pożywce MS z 0,5 mg/l BA oraz 0,1 mg/l NAA w tabeli odnotowano 11,4 ± 6,2 pędu i 9,2 ± 5,3 zarodka na eksplant po czterech miesiącach, jako średnie ± błąd standardowy. Kalus przeniesiony na świeżą pożywkę bez regulatorów zachowywał zdolność embriogenezy przez kolejne miesiące. [Malda i wsp. 1999b, s. 74–75, tabela 1]

Mikrorozmnażanie przez pąki powiela wyjściowe genotypy. Regeneracja przez kalus i embriogenezę może dodatkowo wiązać się ze zmiennością somaklonalną, powstającą podczas kultury. Autorzy rozpatrywali te różnice w planowaniu ochrony. Liczne rośliny z jednego eksplantatu tworzą liczny klon. Reprezentowanie różnorodności populacji wymaga szerszego materiału wyjściowego, obejmującego wiele nasion lub roślin o znanym pochodzeniu. W badaniu nie wykonano analizy genetycznej potwierdzającej stabilność każdej linii. [Malda i wsp. 1999b, s. 83]

Kwasowość tkanek i metabolizm CAM

Kultury z 1999 r. utrzymywano w 25–27°C, przy 16 godzinach światła oraz strumieniu fotonów około 120–130 µmol m⁻² s⁻¹. Metabolizm CAM wiąże się z nocnym gromadzeniem kwasów organicznych i wykorzystaniem ich w fazie jasnej. Autorzy pobierali gramowe próbki tkanek w różnych porach cyklu, w trzech powtórzeniach, i miareczkowali ekstrakty do pH 7. Wykres dla O. denegrii pokazuje wzrost kwasowości w ciemności i jej spadek w świetle, z różnicami między zarodkami somatycznymi, pędami in vitro i rocznymi siewkami prowadzonymi poza kulturą. [Malda i wsp. 1999b, s. 73–75, rycina 3a s. 79]

Kwasowość miareczkowa określa zasób kwasów w tkance. W tej publikacji służyła jako pośredni wskaźnik zmian metabolizmu, bez bezpośredniego pomiaru przepływu CO₂ u Obregonia. Osobne badanie Malda, Backhausa i Martina dotyczyło Pelecyphora minima (w publikacji Coryphantha minima). W dostępnym abstrakcie opisano analizę wymiany gazowej i pobór CO₂ w świetle oraz ciemności podczas kultury, a po przeniesieniu poza naczynie powrót do typowego rytmu CAM. Wynik gazowy odnosi się do tego gatunku i tego osobnego doświadczenia. [Malda i wsp. 1999b, Malda, Suzán i Backhaus s. 74–75 i 81, Malda, Backhaus i Martin abstrakt] [Malda i wsp. 1999a, Malda, Suzán i Backhaus s. 74–75 i 81, Malda, Backhaus i Martin abstrakt] [2-WWW]

Aklimatyzacja i samodzielny wzrost

Malda i współautorzy ukorzeniali nowe pędy zarówno w kulturze, jak też po przeniesieniu do podłoża. U O. denegrii pożywka z IBA dawała 64% ukorzeniania, a spontaniczne ukorzenianie w kulturze 28%. Po zakończeniu tej fazy rośliny trafiały do mieszaniny torfu, perlitu i grubego piasku 1:1:1. Wilgotność powietrza stopniowo obniżano przez zdejmowanie osłon. Dalszy rozwój obejmował więc zmianę całego otoczenia korzeni i pędu. [Malda i wsp. 1999b, s. 74, tabela 2 s. 76]

Cztery miesiące po aklimatyzacji przeżywało 98% roślin wcześniej spontanicznie ukorzenionych in vitro, 75% ukorzenianych poza kulturą i 93% półrocznych roślin otrzymanych przez embriogenezę somatyczną. Artykuł nie podaje jednoznacznej liczebności tych grup. Wyniki określają zdolność do dalszego życia w warunkach uprawowych zastosowanych po kulturze. Reintrodukcja do naturalnego siedliska stanowi kolejny etap, wymagający odrębnej oceny przeżycia, pochodzenia genetycznego i zdolności rozmnażania. [Malda i wsp. 1999b, tabela 3 s. 78, dyskusja s. 83–84]