Regeneracja Ariocarpus kotschoubeyanus in vitro. Od brodawki do ukorzenionej rośliny

Brodawki siewek jako materiał wyjściowy

Moebius-Goldammer, Mata-Rosas i Chávez-Avila rozpoczęli pracę od 250 nasion Ariocarpus kotschoubeyanus pochodzących z kolekcji Ogrodu Botanicznego UNAM. Po przygotowaniu do aseptycznej kultury około 70% kiełkowało w okresie 8–50 dni. Pierwsza lub druga brodawka rozwijała się po 13–15 tygodniach. Z takich siewek wycinano u podstawy brodawki długości 2–7 mm i umieszczano je na pożywce. Autorzy odnotowali dalszy rozwój siewek po pobraniu tych fragmentów. [Moebius-Goldammer i wsp. 2003, s. 388–390]

Kultury utrzymywano w 26 ± 2°C, przy szesnastogodzinnym oświetleniu o gęstości strumienia fotonów 50 µmol m⁻² s⁻¹. Podstawą była pożywka Murashige’a i Skooga, z sacharozą 30 g/l i pH 5,7. Porównywano kombinacje regulatorów wzrostu: BA (6-benzyloaminopuryny) z NAA (kwasem 1-naftylooctowym) oraz kinetyny z 2,4-D. W każdym wariancie były trzy naczynia, każde z dwoma wycinkami brodawek. Warunki te dotyczą sterylnej kultury małych fragmentów rośliny. [Moebius-Goldammer i wsp. 2003, s. 390, tabela 1]

Dwie drogi powstawania pędów

W organogenezie bezpośredniej nowe pędy rozwijały się z areoli wyciętej brodawki. Pierwsze były widoczne po około pięciu tygodniach na pożywkach z BA, czyli cytokininą. Organogeneza pośrednia rozpoczynała się od kalusa: tkanki powstającej na wycinku. Po sześciu tygodniach pojawiały się w nim bardziej zwarte, guzkowate obszary, a później małe rozetki brodawek tworzące nowy pąk pędowy. [Moebius-Goldammer i wsp. 2003, s. 389–391, ryc. 1, tabela 1]

Odpowiedź silniej zaznaczała się przy BA i NAA niż przy kinetynie i 2,4-D. Najwyższa średnia organogenezy pośredniej wyniosła 6,3 ± 5,6 pędu na wycinek przy BA 13,3 µM i NAA 5,4 µM. Zmienność podano jako błąd standardowy. Podobną średnią 6,2 pędu uzyskano z samym BA 4,4 µM. Przy sześciu wycinkach na wariant i dużym rozrzucie te wyniki opisują odpowiedź konkretnych kultur oraz materiału użytego w badaniu. [Moebius-Goldammer i wsp. 2003, s. 390–391, tabela 1]

Po przeniesieniu wyodrębnionych pędów na pożywkę bez regulatorów część zachowywała zdolność tworzenia kolejnych pędów z areoli. Autorzy widzieli w tym możliwość podtrzymywania rozmnażania przez organogenezę bezpośrednią po początkowej indukcji. Droga przez kalus dawała także pędy o nadmiernym uwodnieniu, które czasami powracały do stanu kalusa. Wygląd regenerantu miał więc znaczenie dla dalszego prowadzenia kultury. [Moebius-Goldammer i wsp. 2003, s. 391–392]

Ukorzenianie było odrębnym etapem

Pędy o wysokości 0,5–1,5 cm oddzielano i przenoszono na pożywki do ukorzeniania. Porównywano pełną i połowiczną zawartość soli MS, dodatek węgla aktywnego oraz sposób zamknięcia naczynia. Część pędów umieszczano na pożywce od razu po odcięciu, a część pozostawiano na trzy dni w pustym naczyniu w ciemności, pozwalając powierzchni cięcia się zagoić. [Moebius-Goldammer i wsp. 2003, s. 390–391]

W materiale nadającym się do ukorzeniania uzyskano około 25% ukorzenionych pędów po natychmiastowym przeniesieniu i około 30% po okresie gojenia. Pędy silnie uwodnione nie wytwarzały korzeni. Dodatek węgla aktywnego 1 g/l oraz zamknięcia z filtrem, umożliwiające lepszą wymianę powietrza, sprzyjały ukorzenianiu i ograniczały nadmierne uwodnienie. Ten etap wyraźnie ograniczał liczbę roślin, które mogły opuścić kulturę. [Moebius-Goldammer i wsp. 2003, s. 390–391]

Zarodki somatyczne rozwijały się wolniej i z mniejszą skutecznością

Po około czterech miesiącach autorzy opisali zarodki somatyczne na około 20% wycinków z pożywek zawierających BA 8,9–22,2 µM w kombinacji z NAA 0,5–5,4 µM. Najpierw pojawiały się małe struktury guzkowate, później kuliste formy, a następnie stadium z dwoma liścieniami. Takie zarodki powstają z komórek tkanek rośliny poza procesem zapłodnienia. Obrazy i opis rozwoju stanowiły podstawę ich rozpoznania w tej pracy. [Moebius-Goldammer i wsp. 2003, s. 389, 391, ryc. 1]

Niektóre formy rozpoczynały rozwój przedwcześnie lub miały nieprawidłową budowę, przez co nie tworzyły roślin. Najlepsze dojrzewanie i dalszy rozwój opisano przy pożywce z połowiczną zawartością soli MS, węglem aktywnym i zamknięciem z filtrem. Z tej drogi uzyskano niewiele roślin w porównaniu z organogenezą. Powstanie struktury zarodkowej i uzyskanie z niej rozwijającej się rośliny były zatem osobnymi wynikami. [Moebius-Goldammer i wsp. 2003, s. 391–392]

Rośliny w ziemi i znaczenie materiału z nasion

Ukorzenione regeneranty przenoszono do doniczek o średnicy 8 cm i utrzymywano w szklarni przy wysokiej wilgotności względnej. Autorzy podali przeżycie 95–100% tej grupy oraz pokazali roślinę po roku wzrostu w ziemi. Jest to przeżywalność roślin, które wcześniej przeszły etap regeneracji i ukorzeniania. Wydajność całej metody zależała również od ograniczonego odsetka pędów tworzących korzenie. [Moebius-Goldammer i wsp. 2003, s. 389, 391, ryc. 1]

Rozpoczęcie kultur od nasion umożliwia zachowanie wielu linii materiału, podczas gdy namnażanie pędów z jednego wycinka powiela konkretną linię. Autorzy zaproponowali wykorzystanie regeneracji do dostarczania roślin do kolekcji i jako możliwego narzędzia ochrony gatunku. Wierności genetycznej regenerantów oraz ich trwałego powrotu do naturalnych populacji nie badano. Opisany rezultat obejmuje odtworzenie roślin w kulturze i ich dalszy wzrost pod opieką szklarniową. [Moebius-Goldammer i wsp. 2003, s. 391–392]